Robert Mario De Niro, Jr. sinh ngày 17 tháng 8 năm 1943 tại thành phố New York trong một gia đình nghệ sĩ, bố ông là Robert De Niro, Sr., một họa sĩ và nhà điêu khắc, còn mẹ, bà Virginia Admiral cũng là một họa sĩ[1]. Ông bà của Robert De Niro, Sr. là những người Ý di cư gốc ở Ferrazzano, tỉnh Campobasso thuộc Molise miền Trung nước Ý[2]. Bố mẹ De Niro gặp nhau tại một lớp học vẽ của Hans Hofmann ở Provincetown, Massachusetts, họ ly dị khi cậu bé Robert mới lên 2.

De Niro lớn lên ở khu Little Italy (khu Tiểu Ý) của Manhattan. Cậu được mẹ ghi danh vào trường phổ thông nghệ thuật High School of Music and Art ở New York nhưng bỏ học khi mới 13 tuổi để gia nhập những băng đảng đường phố ở khu Tiểu Ý. Sau đó De Niro quay trở lại con đường nghệ thuật khi đăng ký vào trường kịch nghệ của Stella Adler cũng như hội nghệ sĩ Actor's Studio do Lee Strasberg đứng đầu. Ở tuổi 16 cậu có vai diễn đầu tiên trong vở kịch Con gấu của Anton Chekhov.